Производство на β-никотинамид мононуклеотид (NMN) в Ешерихия коли

абстрактен

Диабетът е хронично и прогресиращо заболяване с непрекъснато нарастващо разпространение, нарастващ финансов натиск върху световните здравни системи. Наскоро инсулиновата резистентност, отличителен белег на диабет тип 2, се лекува при мишки, лекувани с NAD ⁺ прекурсор β-никотинамид мононуклеотид (NMN) , не се съобщава за токсични ефекти. Въпреки това, NMN има висока цена, необходими са по-ефективни производствени методи. Това проучване предлага биотехнологичен метод за производство на NMN в Escherichia coli . Ние показваме, че бицистронната експресия на рекомбинантна никотинамид фосфорибозил трансфераза (Nampt) и фосфорибозил пирофосфат (PRPP) синтетаза в присъствието на никотинамид (NAM) и лактоза може да бъде успешна стратегия за рентабилно производство на NMN. Протеиновите експресионни вектори, носещи NAMPT ген от Haemophilus ducreyi и PRPP синтетаза от Bacillus amyloliquefaciens с мутация L135I, се трансформират в Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. Производството на NMN достига максимум 15,42 mg на L бактериална култура (или 17,26 mg на грам протеин) в тези клетки, отглеждани в среда PYA8, допълнена с 0,1% NAM и 1% лактоза.

Въведение

Според Международната федерация за диабет броят на възрастните с диабет тип 2 през 2017 г. е бил 425 милиона и се очаква да достигне 649 милиона до 2045 г. В световен мащаб се изразходват 12% от бюджета за здравеопазване (или 727 милиарда долара). за лечение на диабет. Последните проучвания свързват инсулиновата резистентност, отличителна черта на диабет тип 2, с намаляването на митохондриалната функция и понижените нива на NAD ⁺ , както и съотношението NAD ⁺ / NADH, също наблюдавано при стареене. NAD ⁺ присъства във всички живи организми и е добре познат коензим в окислително-редукционни реакции. NAD ⁺ -зависимите протеинови деацетилази като SIRT1 и SIRT6 служат като метаболитни сензори и регулират пътищата надолу по веригата, които в крайна сметка възстановяват митохондриалната функция и чувствителността към инсулин. Тази констатация разширява областта на изследване на ефектите на NAD ⁺ до други дегенеративни заболявания, свързани със стареенето, като: сърдечносъдови, рак, артрит, остеопороза или болести на Алцхаймер.

Β-никотинамид мононуклеотид (NMN) е междинен продукт в NAD ⁺ биосинтеза, произведен от никотинамид (NAM) и фосфорибозил пирофосфат (PRPP) от ензим никотинамид фосфорибозил трансфераза (Nampt) (EC 2.4.2.12). Добрата поносимост, без съобщени странични ефекти при продължително приложение при мишки и предотвратяване на свързания с възрастта физиологичен спад, NMN се оказа ефикасен при лечение на диабет тип 2, предизвикан от високо съдържание на мазнини, чрез възстановяване на митохондриалната дисфункция, свързана със стареенето, и спасяването ефектът на свързания с възрастта спад на нервните стволови клетки.

NAM обикновено се превръща в NMN от ензими, участващи в NAD ⁺ спасителните пътища, като Nampt. Действието на този ензим представлява основната NAD ⁺ анаболна активност в клетката. Регулацията на нуклеотидния метаболизъм на бозайници или микроорганизми обикновено протича чрез консумация на PRPP. PRPP се получава от рибоза-5-фосфат чрез окислителни и неокислителни клони на пентазофосфатния път.

При бактериите NAM най-често се превръща в никотинова киселина (NA) от никотинамидаза, която е интегрирана в пътя на Preiss-Handler, като това се отнася и за Escherichia col . При бозайници не се съобщава за никотинамидазната активност; Вместо това, NAM се преобразува в NMN от един от NAM фосфорибозил трансфераза. Въпреки че при повечето бактерии липсва NAM фосфорибозил трансфераза, ензимът се експресира в Haemophilus ducreyi и Shewanella oneidensis .

Прости и метаболично универсални организми, като Escherichia coli , често се използват в биотехнологиите за контролирана експресия на протеини с желана ензимна активност. Кодирането на ДНК за такива ензими често се въвежда в бактериите чрез експресионни вектори, като pET система от Novagen. PET векторите се трансформират в бактерии, експресиращи T7 РНК полимераза, като Е. coli BL21 (DE3). Контролът на експресията на ензимите се постига с помощта на лак промотор, който се включва в експресията само в присъствието на лактоза (също метаболизирана като източник на въглерод) или нейния синтетичен структурен аналог Изопропил-1-Тио-β-D-галактопиранозид (IPTG) ( не се метаболизира, с постоянна концентрация по време на растеж). Тъй като бактериалният метаболизъм е универсален, изменението на източника на въглерод и концентрацията на субстратите, добавени в средата, са ключови фактори, които трябва да се вземат предвид в биотехнологичния процес.

В стремежа си да разрешим текущия проблем с високата цена на NMN , в предишната си работа предложихме метод за пречистване от бактериални клетки. За по-нататъшна оптимизация на процеса, тъй като успяхме да намерим публикуван само един метод за производство на дрожди, това проучване предлага прост и рентабилен метод на биотехнологично производство на NMN в Escherichia coli .

Резултати

Бактериална трансформация

Множеството подравняване на аминокиселинни последователности, генерирано за предполагаеми NadV от Haemophilus ducreyi , NadV, Shewanella oneidensis MR-1 и Nampt от Mus musculus , показва висока прилика (Фиг. S1), което прави всички тези ензими кандидати за биотехнологичен процес.

Трансформиран Е. coli клетки с nadV (NAMPT) гени, пренасяни от pET28a (+) плазмиди, образуват колонии върху LB Agar плочите, допълнени с канамицин. Не се откриват колонии на плаки, инокулирани с нетрансформирани бактериални клетки. Агарозната гел електрофореза на плазмидна ДНК, изолирана от тези колонии, потвърди наличието на плазмиди Nampt-PET28a, pET28a-soNadV или pET28a-hdNadV в Е. coli DH5α (Допълнителна фиг. S2A, лента 2, 3, 4). ДНК лентите съответстват на лентите от Е. coli BL21 (DE3) pLysS клетки (допълнителна фиг. S2A, лента 6, 7, 8), които се трансформират със съответните плазмиди, екстрахирани директно от Е. коли DH5α. В непреобразуван Д. coli BL21 (DE3) pLysS клетки, използвани като отрицателен контрол, присъствието на pLysS плазмид беше потвърдено чрез електрофореза, лента, съответстваща на известната дължина 4886 bp (допълнителна фиг. S2A, лента 5), беше показана на агарозен гел.

(За повече експериментални данни вижте оригиналния уебсайт: https://www.nature.com/articles/s41598-018-30792-0#Sec14)